细胞功能实验那些事血管生成实验

中科白癜风医院好吗 http://www.xxzywj.com/npxxx/npxtj/780.html

1、血管生成介绍

血管生成（也可称为血管形成），是指新血管从现有的血管网络中生长出来的复杂过程。这一过程在生理和病理状态下都发挥着重要作用。生理性血管生成由组织缺氧或氧张力不足触发，通过一系列高度有序的细胞事件，如血管起始、发芽、形成、成熟、重塑和退化，来满足组织对氧气和营养的需求，这在胚胎发育、支持伤口愈合、骨骼生长及怀孕等生理性过程中至关重要。生理性血管生成涉及促血管生成和抗血管生成信号的平衡，其中包括整合素、趋化因子、血管生成素、氧传感器等。这种平衡确保血管生成的有序性和功能性。

然而，当血管生成信号失调则会引起病理性血管生成。相较于生理性血管生成，病理性血管生成的特点是血管的异常形成和成熟、重塑或退化，与癌症、心脑血管疾病及伤口愈合受损等许多疾病状态有关。因此，研究不同生理病理环境下的血管生成及调控机制，对于理解组织损伤和疾病发展有着重要的意义。

2、血管生成过程

（1）血管生成起始：当血管周围的环境富集一些促血管生成因子时，如成纤维细胞生长因子（FGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）等，会激活血管内皮细胞（VEC）。

（2）发芽-增殖-迁移：VEC通过上调基质金属蛋白酶家族（MMPs）的表达，降解基底膜使其形成开口，并促进周细胞脱离，VEC则逐渐由此向外增殖和迁移。

（3）血管生成：VEC向外发展的同时重新组装，并建立新的细胞间接触和血管腔。

（4）血管成熟：新血管腔中重新形成血管平滑肌细胞和周细胞，使新生血管获得完整的结构和功能。

图1血管生成过程[1]

3、研究血管生成的方法

研究血管生成的方法或模型是旨在模仿体内血管新生的复杂过程，主要分为体内（invivo）和体外（invitro）两大类。体内模型即活体动物实验，可以提供完整的生物环境来研究血管生成的动态过程；而体外模型（如血管生成实验）虽然缺乏完整的生理环境，但可以直接对特定细胞类型和信号通路进行调控，以研究特定因素对血管生成的影响。

血管生成实验可广泛应用于解决各种实验问题，例如：研究某种药物的促血管或抗血管生成能力、与血管生成相关的基因及信号途径、血管生成对不同组织生理功能的调节、哪些细胞参与了血管生成等等。下面我们进一步了解下血管生成实验及其实验过程。

4、血管生成实验

体外细胞培养的血管生成实验是年由Kubota及其同事首次提出，至今依旧是用于研究血管生成最广泛的体外实验之一。在这一实验中，内皮细胞在含有类似基底膜的基质胶上培养，其能够迁移、增殖并形成管状结构，类似于血管。接着通过观察和量化管状结构的形成，可以评估不同条件或药物对血管生成的影响。

图2体外血管生成（来源于网络）

实验前，选择合适的内皮细胞和基底膜样基质是准确研究血管生成的关键。在选择用于血管生成研究的内皮细胞时，需要考虑细胞的来源、纯度和特性，可以来源于不同的物种（如人类、小鼠）和不同的器官（如肺、脑），每种来源的细胞可能具有不同的特性和响应模式；常用的内皮细胞包括人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和微血管内皮细胞等。另外，使用原代细胞可以提供更真实的生理反应，而永生化细胞系则可能更容易处理且一致性更高，但可能失去某些原代细胞特性。基底膜样基质则是模拟了体内血管周围的细胞外基质环境，由多种细胞外基质蛋白和糖胺聚糖等组成，能够支持内皮细胞的粘附、迁移和管状结构的形成。

实验材料及过程

①实验材料：内皮细胞（如HUVEC），DMEM培养基，Matrigel或ECM凝胶，预冷的枪头、96孔板和1.5mL离心管，胰酶，PBS等。

②实验步骤：

1）实验前细胞培养：将HUVEC进行正常的细胞培养及传代，实验前将适量细胞接种于培养容器中，使接种后24h内达到70-90%的细胞汇合度。

2）准备凝胶：从-20℃或-80℃冰箱中取出Matrigel凝胶，于4℃冰箱中过夜至完全解冻，随后用预冷的枪头将Matrigel凝胶混匀；

3）Matrigel凝胶包被96孔板：将50-80μL的Matrigel凝胶加入96孔板的每个孔中，并置于37℃培养箱中孵育30-60min，以形成Matrigel凝胶基底。

4）准备待测培养基：将待测药物或处理因素溶解到培养基中，并设置相应的实验组、对照组和空白对照组。

5）分离HUVEC：将第一步中培养好的HUVEC进行消化、离心和计数，并制成单细胞悬液，浓度约为每毫升培养基中含有10万-15万个细胞。

6）接种HUVEC：将μL的单细胞悬液（约1-1.5万个细胞）接种至包被有Matrigel凝胶的96孔板中，于37℃培养箱中培养4-24h，可在不同时间点进行拍照观察管状结构形成情况。

7）图像分析：结果可通过光学显微镜直接成像观察，也可通过钙黄绿素标记或结晶紫染色观察，保存图像后使用ImageJ进行定量分析即可。

图3血管生成实验结果图像示例[2]

参考文献

[1]EndothelialCellTubeFormationAssay(AngiogenesisAssay)

[2]DeCicco-SkinnerKL,HenryGH,CataissonC,TabibT,GwilliamJC,WatsonNJ,BullwinkleEM,FalkenburgL,ONeillRC,MorinA,WiestJS.Endothelialcelltubeformationassayfortheinvitrostudyofangiogenesis.JVisExp.Sep1;(91):e.doi:10./.